Updating recommendations of the Brazilian Group of Flow Cytometry (GBCFLUX) for diagnosis of acute leukemias using four-color flow cytometry panels

ABSTRACT Introduction: Flow cytometry has become an increasingly important tool in the clinical laboratory for the diagnosis and monitoring of many hematopoietic neoplasms. This method is ideal for immunophenotypic identification of cellular subpopulations in complex samples, such as bone marrow and peripheral blood. In general, 4-color panels appear to be adequate, depending on the assay. In acute leukemias (ALs), it is necessary identify and characterize the population of abnormal cells in order to recognize the compromised lineage and classify leukemia according to the WHO criteria. Although the use of eightto ten-color immunophenotyping panels is wellestablished, many laboratories do not have access to this technology. Objective and Method: In 2015, the Brazilian Group of Flow Cytometry (Grupo Brasileiro de Citometria de Fluxo, GBCFLUX) proposed antibody panels designed to allow the precise diagnosis and characterization of AL within available resources. As many Brazilian flow cytometry laboratories use four-color immunophenotyping, the GBCFLUX has updated that document, according to current leukemia knowledge and after a forum of discussion and validation of antibody panels. Results: Recommendations for morphological analysis of bone marrow smears and performing screening panel for lineage (s) identification of AL were maintained from the previous publication. The lineage-oriented proposed panels for B and T cell acute lymphoblastic leukemia (ALL) and for acute myeloid leukemia (AML) were constructed for an appropriate leukemia classification. Conclusion: Three levels of recommendations (i.e., mandatory, recommended, and optional) were established to enable an accurate diagnosis with some flexibility, considering local laboratory resources and patient-specific needs.

Análise fatorial da adsorção de cobre em solução aquosa por hidroxiapatita / Factor analysis of copper adsorption in aqueous solution by hydroxyapatite

RESUMO O cobre (Cu) é um contaminante frequente das águas residuais, o que pode levar a intoxicação humana e danos ambientais. A hidroxiapatita (HAP) pode ser utilizada para remoção dessa substância de efluentes, pois é de fácil produção e alto rendimento. Assim, o presente estudo objetivou analisar a influência de vários fatores (factorial design) na adsorção do Cu+2 em solução. A HAP foi produzida por meio de precipitação aquosa e, subsequentemente, caracterização por difração de raios X (DRX), espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR), espectroscopia por energia dispersiva (EDS) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM). A influência das variáveis pH, concentração inicial (Ci) e massa adsorvente na adsorção de Cu+2 foi analisada por intermédio de um planejamento fatorial 12 (23), com 4 pontos centrais. As três variáveis analisadas foram estatisticamente significantes, sendo possível observar remoções acima de 80% do metal dissolvido em solução. A análise de variância (ANOVA) mostrou que o pH da solução (1), a massa adsorvente (3), a concentração inicial de metal (2) e a interação 2x3 (23) foram estatisticamente significantes. A eficiência máxima de remoção de Cu+2 obtida no procedimento de otimização foi de 85,33%.

ABSTRACT Copper is a frequent contaminant of wastewater, which can lead to human intoxication and environmental damage. The hydroxyapatite (HAP) can be used to remove this substance from wastewater, as it is easy to produce and has high yield. Thus, the present study aimed to analyze the influence of several factors (factorial design) on the adsorption of Cu+2 in solution. HAP was produced by means of aqueous precipitation and subsequently characterized by XRD, FTIR, EDS, and TEM. The influence of the variables pH, initial concentration (Ci), and adsorbent mass on the adsorption of Cu+2 was performed through 12 factorial design (23), with four central points. The three variables analyzed were statistically significant, being possible to observe removals above 80% of the dissolved metal in solution. The analysis of variance (ANOVA) showed that the pH of the solution (1), the adsorbent mass (3), the initial concentration of metal (2), and the interaction 2×3 were statistically significant. The maximum Cu+2 removal efficiency obtained in the optimization procedure was 85.33%.

Updating recommendations of the Brazilian Group of Flow Cytometry (GBCFLUX) for diagnosis of acute leukemias using four-color flow cytometry panels.

INTRODUCTION: Flow cytometry has become an increasingly important tool in the clinical laboratory for the diagnosis and monitoring of many hematopoietic neoplasms. This method is ideal for immunophenotypic identification of cellular subpopulations in complex samples, such as bone marrow and peripheral blood. In general, 4-color panels appear to be adequate, depending on the assay. In acute leukemias (ALs), it is necessary identify and characterize the population of abnormal cells in order to recognize the compromised lineage and classify leukemia according to the WHO criteria. Although the use of eight- to ten-color immunophenotyping panels is wellestablished, many laboratories do not have access to this technology. OBJECTIVE AND METHOD: In 2015, the Brazilian Group of Flow Cytometry (Grupo Brasileiro de Citometria de Fluxo, GBCFLUX) proposed antibody panels designed to allow the precise diagnosis and characterization of AL within available resources. As many Brazilian flow cytometry laboratories use four-color immunophenotyping, the GBCFLUX has updated that document, according to current leukemia knowledge and after a forum of discussion and validation of antibody panels. RESULTS: Recommendations for morphological analysis of bone marrow smears and performing screening panel for lineage (s) identification of AL were maintained from the previous publication. The lineage-oriented proposed panels for B and T cell acute lymphoblastic leukemia (ALL) and for acute myeloid leukemia (AML) were constructed for an appropriate leukemia classification. CONCLUSION: Three levels of recommendations (i.e., mandatory, recommended, and optional) were established to enable an accurate diagnosis with some flexibility, considering local laboratory resources and patient-specific needs.

P-glycoprotein and multidrug resistance-associated protein-1 expression in acute myeloid leukemia: Biological and prognosis implications.

BACKGROUND: Despite the advances in the cure rate for acute myeloid leukemia (AML), a considerable number of patients die from the disease due to the occurrence of multidrug resistance (MDR). Overexpression of the transporter proteins, such as P-glycoprotein (Pgp) and multidrug resistance-associated protein (MRP), confers resistance to the treatment of these leukemias. METHODS: To analyze the expression of the Pgp and MRP1 in patients with AML and determine their correlation between expression and demographic, clinical, and laboratorial variables, bone marrow and peripheral blood samples from 346 patients with a diagnosis of AML were assessed for the expression of Pgp and MRP1 by flow cytometry. RESULTS: The expression of Pgp and MRP1 was found in 111 (32.1%) and 133 (38.4%) patients, respectively, with greater prevalence in older patients and lower in children, while also observing a high incidence in patients with refractory, recurrence, and secondary disease in comparison with the cases of de novo AML. Regarding the laboratory findings, we observed an association between the expression of Pgp and MRP1 and CD34, CD7, and also M7, M5a, and M2-AML of French-American-British classification. CONCLUSIONS: The results showed that the detection of MDR phenotype by flow cytometry can be a molecular marker for prognosis of patients with AML.

Exploring the Association of Surface Plasmon Resonance with Recombinant MHC:Ig Hybrid Protein as a Tool for Detecting T Lymphocytes in Mice Infected with Leishmania (Leishmania) amazonensis.

A surface plasmon resonance- (SPR-) based recognition method applying H-2 Ld:Ig/peptides complexes for ex vivo monitoring cellular immune responses during murine infection with Leishmania (Leishmania) amazonensis is described. Lymphocytes from lesion-draining popliteal lymph nodes were captured on a carboxylated sensor chip surface previously functionalized with H-2 Ld:Ig (DimerX) protein bound to synthetic peptides derived from the COOH-terminal region of cysteine proteinase B of L. (L.) amazonensis. In computational analysis, these peptides presented values of kinetic constants favorable to form complexes with H-2 Ld at neutral pH, with a Gibbs free energy ΔG° < 0. The assayed DimerX:peptide complexes presented the property of attaching to distinct T lymphocytes subsets, obtained from experimentally infected BALB/c mice, in each week of infection, thus indicating a temporal variation in specific T lymphocytes populations, each directed to a different COOH-terminal region-derived peptide. The experimental design proposed herein is an innovative approach for cellular immunology studies of a neglected disease, providing a useful tool for the analysis of specific T lymphocytes subsets.

Flow cytometry immunophenotyping evaluation in acute lymphoblastic leukemia: correlation to factors affecting clinic outcome.

The authors conducted a flow cytometry immunophenotyping study in patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL) from Natal, Rio Grande do Norte, Brazil. The patients (n = 126) were newly diagnosed using a panel of monoclonal antibodies: CD1a, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD10, CD13, CD33, CD14, CD19, CD22, CD79a, CD117, CD34, anti-IgM, anti-TdT, anti-HLA-Dr, and anti-human kappa and lambda light chains. Additional data, such as patients' age and gender, clinical and laboratory findings such as presence of tumor masses, lymphadenopathy, hepatomegaly, splenomegaly, leukemic infiltration in the central nervous system (CNS) were also investigated. Results showed that 56.7% of the cases were B-lineage ALL and 55% were T-cell ALL. Also, we found that males were more affected by the disease, regardless of immunological classification. The correlation between age and immunological subtypes showed that the B-lineage ALL occurred more frequently in patients aged under 15 while the T-cell ALL subtype was more frequent in adults. Immunophenotypic profiles and morphological subtypes showed a direct correlation between L3 subtype and B-lineage ALL, while L1 and L2 subtypes correlated more often with B-cell lineage and T-cell ALL, respectively. Correlation analysis between immunophenotypic and clinical profiles showed that T-cell ALL was more associated with a higher incidence of lymphadenopathy, hepatomegaly, splenomegaly and CNS leukemic infiltration, also showing a greater blast cell count in peripheral blood than the other subgroups. The presented data suggest that immunophenotyping is an important method in the diagnosis, monitoring and prognostic assessment in determining the pathological mechanisms of evolution of ALL.

Avaliação da sensibilidade da citopatologia através de estudo comparativo com a colposcopia emportadoras de lesões cervicais induzidaspelo papilomavírus humano / Sensitivity evaluation of cytopathology by comparative study with colposcopy ininduced cervical lesion porters through human papillomavirus

O cancer cervical e o segundo mais comum entre mulheres no mundo e apresenta altas taxas de mortalidade feminina, tendo sido demonstrado o envolvimento do Papilomavirus humano (HPV) em 99,7% dos tumores cervicais. Realizou-se estudo retrospectivovisando avaliar a sensibilidade da citopatologia para lesoes cervicais associadas ao HPV, atraves de analise comparativa com a colposcopia, em mulheres atendidas em Clinica Privada da cidade de Natal – RN, no periodo de 2004 a 2007. Analisou-se 504 laudoscitopatologicos e colposcopicos. Os resultados demonstraram prevalencia da papilomavirose em 4,96% dos casos, para os dois metodos, na faixa etaria acima de 36 anos. Na citopatologia foi evidenciada associacao da virose com metaplasia escamosa (28%), lesoesintra-epiteliais de baixo grau – LSIL (4,37%), lesoes intra-epiteliais de alto grau - HSIL (0,60%) e atipias de significado indeterminado em celulas escamosas - ASC-US (0,40%). Quando comparados, os resultados apresentaram-se concordantes em 80% dos casos e discordantes em 20%. Conclui-se que a citopatologia apresentou alta sensibilidade para rastreamento das lesoes cervicais associadas ao HPV na clientela estudada.

Cervical cancer is the second most common type in women around the world, present high rate of feminine mortality, had been demonstrated an involvement of Human Papillomavirus (HPV) in 99,7% of cervical lesions. It was made a retrospective study focusing on sensitivity evaluation of cytopathology in cervical lesions with HPV association, through comparative analysis with colposcopy, in women patients of a Private Clinic at Natal – RN, from April 2004 to April 2007. 504 cytopathological and colposcopicalexams were analysed. The results shaw 4,96% of papillomavirus prevalence for both methods, mainly in patients older than 36 years. In cytopathology was evidenced events associated to squamous metaplasy (28%), Low-grade aquamous intraepithelial lesion –LSIL (4,37%), High-grade squamous intraepithelial lesion - HSIL (0,60%) and Atypical squamous cells of undetermined significance - ASC-US (0,40%). According the results, it was verified that 80% of cases were coincidents for cervical lesions by HPV with 20% of divergence. The present study concluded that cytopathology presented high sensitivity for cervical lesions associated to HPV investigationin studied customers.

Coexpressão da proteína p53 e proteínas relacionadas a resistência a múltiplas drogas em diferentes tipos de leucemias: associação predominante nos estágios avançados da doença / Coexpression of p53 protein and multidrug resistance proteins in diferents types of leukemias: the predominant association in advanced status of disease

Um dos mais bem caracterizados mecanismos de resistência às drogas (MDR) nas leucemias são os mediados pela glicoproteína P (PGP) e proteína relacionada a múltiplas drogas (MRP). Diversos relatos têm demonstrado que a superexpressão dessas proteínas podem ser medianas pela superexpressão da proteína p53 inativada. O objetivo deste estudo foi investigar a co-expressão da p53, PGP e MRP em diferentes tipos de leucemias pela citometria de fluxo. Analisou-se amostras de 223 pacientes leucêmicos: 64 leucemia linfocítica crônica (LLC), 43 leucemia mielóide aguda (LMA), 44 leucemia linfoblástica aguda (LLA), e 72 leucemia mielóide crônica (LMC). A p53 foi observada em 23,6% na LMC, 21,8% na LLC, 44,2% na LMA e 29,4% na LLA. A Pgp em 46,4% na LMC, 47,5% LLC, 62,8% LMA e 20% LLA e a MRP em 31,9% na LMC, 40,6% na LLC, 44,2% na LMA e 40,1% na LLA. Observou-s co-expressão estatisticamente significativa entre p53 e Pgp na LMC (p=0,0066) e na LMA (p=0,0013) e p53 e MRP na LMC (p=0,000066), na LLC (p=0,0079) e LMA (0,00044), sendo observado predomínio dessas associações nos estágios avançados dessas doenças. Estes resultados demonstraram que as pesquisas desses marcadores possam servir como indicadores de evolução clínica e prognóstico para estas leucemias.

Uso simultâneo do método do polimorfismo conformacional de fita simples e da citometria de fluxo no aumento da eficácia da detecção de anormalidades do gene e da proteína p53 na leucemia mielóide crônica / Simultaneous use of the single strand conformation polymorphism method and flow cytometry for increasing the detection efficacy of abnormalities in the gene and p53 protein in chronic myeloid leukemia

A proteína p53 desempenha um importante papel no controle do ciclo de celular e reparo no DNA danificado. Em pacientes com leucemia de mielóide crônica (LMC) as mutações neste gene são encontradas em até 30% dos casos, especialmente na crise blástica (LMC-CB), sendo a detecção de alterações nesse gene ou proteína importantes na avaliação da evolução clínica da LMC. O sequenciamento de DNA é descrito como o método capaz de identificar as mutações do gene TP53, sendo, no entanto uma técnica complexa e dispendiosa, o que dificulta seu emprego em larga escala, sendo, atualmente, proposto a pesquisa da proteína p53 por métodos imunológicos e a técnica da reação em cadeia da polimerase seguida pelo estudo do polimorfismo conformacional de fita simples (PCR/SSCP). Métodos: Analisaram-se amostras de 72 pacientes com LMC: 54 de LMC em fase crônica (33 fase inicial ou LMC-FCi e 21 em fase crônica tardia ou LMC-FCtd), 7 em fase acelerada ou LMC-Ac e 11 em crise de blástica (LMC-CB). Foram realizados PCR para os exons 5-9 para posterior estudo pelo SSCP e a expressão de proteína de p53 foi feita por citometria de fluxo. Resultados: Na análise do PCR-SSCP, alterações de mobilidade eletroforética indicativa de mutação do gene de TP53 foi observado em 11/72 pacientes e a expressão da proteína p53 em 17/72 pacientes. O SSCP anormal foi visto em dois casos de LMC-FCi (exon 7), quatro LMC-FCt (um exon 7, um exon 8 e dois exons 8-9), um na LMC-FAc (exon 8) e quatro na LMC-CB (dois no exon 5, um no exon 6 e um no exon 8-9). Neste grupo, a proteína de p53 estava expressa sete casos (todas LMC-CB e AC e 2 LMC-FCtd), havendo correlação estatisticamente significativa entre os resultados dos dois métodos. Conclusões: Estes resultados sugerem que os dois métodos conjuntamente empregados podem aumentar a sensibilidade na detecção de anormalidades do gene e proteína p53 nos pacientes com LMC. A presença de SSCP anormal associado à expressão da proteína de p53 nas fases avançadas desta doença na maioria de casos, sugere que estes exames possam se empregados como indicadores de progressão para a LMC.

The p53 protein play an important role in the control of the cell cycle and DNA repair. In patients with chronic myeloid leukemia (CML) mutation in this gene were found in up to 30%, especially among those in blast crisis. At present, the only widely available technology that reliable detects and defines all mutations is DNA sequencing. However, the routine sequencing of the entire TP53 gene in all cases suggestive of mutation in the laboratorial routine is prohibitively costly, complex, and time consuming. To screen for TP53 abnormalities in CML patients, both p53 protein expression bay immunologic methods and single strand conformation polymorphism of polymerase chain reaction products (SSCP-PCR) is proposed. Methods: We report the results of an analysis of 72 samples from CML patients:54 in chronic phase :33 in initial phase (ICP-CML) and 21 in late phase (LCP-CML), 7 in accelerated phase (AP-CML) and 11in blast crisis (BC-CML). DNA structure for 5-9 exons of the TP53 gene were analyzed by PCR-SSCP and p53 protein expression by flow cytometry (CF). Results: By PCR-SSCP analysis, shifts in eletrophoretic mobility of the TP53 gene were detected in 11 out of CML patients and p53 protein expression in 17 out of 72 CML patients. The abnormal SSCP pattern were showed in two cases of ICP-CML (exon 7), four LCP-CML (one exon 7 and exon 8 and two exons 8-9), one in AP-CML (exon 8) and four in BC-CML (two in exon 5, one in exon 6 and one in exon 8-9). In this group, the p53 protein were express in 17 cases (all CB and AC of CML patients and 2 out of 5 LCP samples of CML patients) and the statistical analysis by qui-square test showed correlation between this two tests. Conclusions: These results suggest that the two methods together can increase the sensibility of screening for p53 abnormalities in CML patients. The presence of abnormal SSCP associated to the p53 protein expression in advanced phases of this disease in the most of cases, suggesting that these tests can be used as an indicator of progression of CML.

Avaliação da eficácia das reações de imunofluorescência indireta e hemoaglutinação indireta na investigação sorológica para toxoplasmose em parturientes e recén-natos / Efficacy evaluation of the indirect immunofluorescence and indirect hemaglutination reaction in pregnancy and new born serologic toxoplasmosis investigation

A toxoplasmose é uma parasitose prevalente em todo o mundo, quando adquirida durante a gestação pode ser transmitida ao feto e causar, entre outros problemas, atraso no desenvolvimento neuropsicomotor, déficit visual e de audição. A prevenção da transmissão vertical deve ser iniciada antes da concepção ou o mais precocemente possível durante o exame pré-natal. Neste trabalho, foi realizado um estudo objetivando a avaliação da soroprevalência da toxoplasmose em parturientes e seus recém-natos (RN),atendidos na Maternidade Escola Januário Cicco da UFRN, através de um estudo comparativo entre as técnicas da hemaglutinação indireta (HAI) e a imunofluorescência indireta (IFI). Paralelamente, também, se procurou padronizar a técnica de IFI, utilizando-se a coleta de sangue capilar com impregnação em papel de filtro. Das amostras sanguíneas de 63 parturientes e respectivos RN avaliadas por IFI, obteve-se uma reatividade para toxoplasmose de 30,2% e de 3,2%, respectivamente. A utilização da IFI empregando-se a coleta de sangue capilar com impregnação em papel de filtro apresentou baixa sensibilidade (71,4%), mostrando a necessidade de se intensificar os estudos para completar a padronização desse método. No entanto, foi observada uma boa correlação entre a IFI e a HAI. Os casos de IFI para cadeia pesada das imunoglobulina humana (IgH) apresentaram elevados títulos para IgG específica na maioria dos casos, sendo que três destes apresentaram reatividade para a IgM. Estes dados mostram a importância da investigação sorológica para toxoplasmose nesse grupo e pacientes

Caracterização e correlação do fenômeno pró-zona com títulos de sororeatividade do VDRL e reação de imuno-fluorescência indireta em soros de pacientes com sífilis / Characterization and correlation of prozone phenomenos whit seroreactivity and indirect immunofluorescence in sero from patients with syphilis

Introdução: Treponema pallidun é o agente etiológico da sífilis uma doença sexualmente transmissível. No imunodiagnóstico dessa doença utilizam-se dois diferentes tipos de testes sorológicos. Inicialmente, as amostras são triadas qualitativamente e quantitativamente por um teste não treponêmico como o veneral disease research laboratory (VDRL) e, em seguida, os soros reagentes são testados para a detecção de anticorpos específicos para o treponema pallidun, como a reação de imunofluorescência indireta através do fluorescent treponemal antibory absorption assay (FTA-ABS). Objetivos e Metodologia: Avaliar através do VDRL quantidativo a sororeatividade de 40 pacientes com sífilis e comparar com a presença do fenômeno pro-zona e resultados obtidos pelo FTA-ABS. Resultados e Discussão: Os níveis de reatividade das amostras testadas pelo VDRL variam de 1:2 a 1:256. O fenômeno pró-zona foi observado em 8/40 soros (20) se correlacionando com altos títulos de reatividade na maioria dos casos. O FTA-ABS foi reagente em 39/40 amostras (97,5).

Detecção da proteína p53 em células leucêmicas por citometria de fluxo e imunocitoquímica / Detection of p53 protein in leukemic cells by flow cytometry and immunocytochemistry

Introdução: A proteína p53 desempenha uma função crucial no controle do ciclo celular, reparo do DNA e na indução de apoptose em células geneticamente instáveis. A imunocitoquímica (ICQ) é um dos métodos preconizados para detecção e visualização dessa proteína no núcleo das células, sendo, no entanto um método demorado e trabalhoso o que dificulta a sua aplicação na rotina laboratorial. Atualmente, a citometria de fluxo (CF) também tem sido empregada na detecção da proteína p53 mutada ou estabilizada tendo a vantagem da praticidade e rapidez de execução. Objetivos e Metodologia: Comparar os resultados obtidos pela CF e ICQ na detecção da proteína p53 em células leucêmicas. Empregamos amostras de 10 pacientes com leucemia linfóide aguda (LLA) 10 com leucemia linfóide crônica (LLC), tendo sido também empregadas, células de linhagens leucêmicas humanas que serviram como controle de expressão positiva e negativa para ambos os métodos além de linfócitos de 40 doadores de sangue. A CF e ICQ foram realizadas após a marcação com anticorpo monoclonal anti-p53 por técnicas convencionais. Resultados: Observamos concordância nos resultados da maioria das amostras dos pacientes e em todas as amostras das linhagens elulares tendo sido, no entanto constatados níveis de expressão mais elevados nas análises obtidos pela CF quando comparados com a ICQ, refletindo em uma maior sensibilidade desse método. Conclusão: Apesar da ICQ ser considerada uma técnica adequada para a detecção da p53, nossos resultados indicam que a CF pode ser empregada satisfatoriamente na detecção dessa proteína em amostras de células leucêmicas.

Introduction: The p53 protein plays a crucial role in the cell cycle control, DNA damage repair and induction of apoptosis in genetically unstable cells. The immunocytochemistry (ICQ) is one of the most common methodology for detection and visualization of this protein in the nucleus of the cells, but this technique is time-consuming and difficult to apply in the clinical setting. Nowadays the assessment of p53 protein expression by flow cytometry (FC) assays are easier to perform and provide reliable estimates of the prolonged half-life of mutant or inactivated wild-type p53 protein. Objectives and Methodology: Compare the results of p53 detection by FC and ICQ in leukemic cells. We used samples from 10 patients with acute lymphoid leukemia (ALL), 10 with chronic lymphoid leukemia (CLL). To positive and negative controls of p53 expression in both methods we also employed leukemic cells from human leukemic cell lines an lymphocytes from 40 healthy donors were also used as control for negative labeling in FC. The FC and ICQ were performed after labeling with p53 monoclonal antibody by the usual protocol. Results: We verified an agreement in the results in the majority of the leukemic cells from patients and in all human leukemic cell line samples. Conclusion: Despite of ICQ is considered a good methodology for p53 detection in leukemic cells; our results show that FC can be satisfactorily used for detection of this protein in leukemic cells.

Detection of CD5 in B-cell chronic lymphoproliferative diseases by flow cytometry: a strong expression in B-cell chronic lymphocytic leukemia.

PURPOSE: CD5 is a T cell marker, aberrantly express in B cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) and mantle cell lymphoma (MCL). Other chronic B cell malignancies including hairy cell leukemia (HCL) and B cell prolymphocytic leukemia (B-PLL) are CD5 negative or express this antigen in a weak way. In this study, CD5 expression was investigated in leukemic cells from 42 patients with chronic B cell lymphoproliferative disease. METHODS: We studied the CD5 expression in leukemic cells from 42 patients with chronic B-cell malignancies by flow cytometry. Demographic features such as age, sex and clinical date were also analyzed. RESULTS: There were 22 males and 20 females. The immunophenotyping showed that 35 cases were B-CLL, 3 B-PLL and HCL and one patient was MCL. CD5 expression was present in all B-CLL and MCL. Low expression of CD5 was observed in one patient with B-PLL and negative in all cases of HCL. CONCLUSION: Our date demonstrated that CD5 expression can help distinguish among B-CLL from HCL and B-PLL, but is similar expressed in MCL.

Chromosome 17 abnormalities and mutation of the TP53 gene: correlation between cytogenetics, flow cytometry and molecular analysis in three cases of chronic myeloid leukemia

Alterations involving the short arm of chromosome 17 (17p) during the progression of chronic myeloid leukemia (CML) have been described. This chromosomal region contains the tumor suppressor gene TP53 that may be an important factor in the evolution of this disease. In this study, we used flow cytometry and western blotting to assess p53 protein expression and single stranded conformational polymorphism to examine TP53 gene alterations in three patients with CML who showed alterations in 17p. Only the case with del(17)(p11) had p53 expression positive by flow cytometry and an abnormal migration pattern by SSCP analysis. The importance of the correlation between the results obtained with these techniques, as well as the clinical course of the patients, are discussed.

Detection of CD5 in B-cell chronic lymphoproliferative diseases by flow cytometry: a strong expression in B-cell chronic lymphocytic leukemia

OBJETIVOS: CD5 é um marcador normalmente expresso nas células T e de forma aberrante nas células B da leucemia linfocítica crônica (LLC) e no linfoma de células do manto (LCM). Outras doenças linfoproliferativas crônicas como a hairy cell leukemia (HCL) e leukemia prolinfocítica de células B (LPL-B), são geralmente CD5 negativas ou expressam fracamente este antígeno. Neste trabalho investigou-se o padrão de expressão do CD5 em 42 pacientes com doenças linfoproliferativas crônicas de células B (DLC-B). METODOS: Investigamos a expressão de CD5 em células leucêmicas de 42 pacientes com DLC-B através da citometria de fluxo. Dados demográficos, tais como idade e sexo, bem como dados clínicos e laboratoriais também foram analisados. RESULTADOS: A imunofenotipagem mostrou que 35 casos foram LLC, 3 LPL-B, 3 HCL e um caso de LMC. O CD5 mostrou-se fortemente expresso em todos os casos de LLC e LMC. Baixa expressão desse antígeno foi observada em um caso de LPL-B, mostrando-se negativamente expresso em todos os casos de HCL. CONCLUSÃO: Nossos resultados demonstram que o padrão de expressão do CD5 pode auxiliar na distinção entre LLC da HCL e LPL-B, sendo no entanto similares na HCL e LCM.

Detecção da proteína p53 em células leucêmicas por citometria de fluxo e Western blot / Detection of p53 protein in leukemic cells by flow cytometry and Western blot

Introdução: A proteína p53 desempenha uma função crucial no controle do ciclo celular, reparo do DNA e naindução de apoptose em células geneticamente instáveis. O Western blot (WB) é o método preconizado paradetecção dessa proteína, no entanto é técnica demorada e trabalhosa. Atualmente, a citometria de fluxo (CF)também tem sido empregada na detecção da proteína p53 tendo a vantagem da praticidade. Objetivos e Metodologia:Comparar os resultados obtidos pela CF e WB na detecção da proteína p53 em células leucêmicas. Empregamosamostras de 3 pacientes com leucemia linfóide aguda (LLA), 5 com leucemia mielóide aguda (LMA), 6 comleucemia mielóide crônica (LMC) e 8 com leucemia linfóide crônica (LLC). Os controles positivos (5) e negativos(4), para os dois métodos, foram linhagens de células leucêmicas. Juntamente com o controle de marcação negativa,na técnica de CF, utilizamos linfócitos de 40 doadores de sangue. A análise pela CF foi realizada após a marcaçãocom anticorpo monoclonal anti-p53 e o WB por técnica convencional. Resultados e Conclusões: Observamosconcordância nos resultados em 82 por cento das amostras leucêmicas e em 100 por cento nas linhagens celulares. CF+/WB+foram observados em pacientes com evolução desfavorável tais como na LLC / Síndrome de Richter, LMC emcrise blástica e na maioria das LMA. Apesar do WB ser considerado um método padrão para a detecção da p53,nossos resultados indicam que a CF pode ser empregada satisfatoriamente na detecção dessa proteína em amostrasleucêmicas.

Relevância clínica e biológica das alterações do gene e proteína p53 nas leucemias

As mutações do gene TP53 e/ou inativação da proteína p53 são as alterações genéticas mais comuns nas neoplasias de humanos. Nas leucemias, estas alterações são observadas com menor freqüência, predominado nas formas mais graves de doenças e nos casos resistentes ao tratamento. O objetivo desse trabalho foi avaliar a expressão da proteína p53 em diversos tipos de leucemias e a mutação do gene TP53 nos pacientes com leucemias mielóide crônica (LMC). Foram avaliadas amostras de sangue periférico e de medula óssea de 64 pacientes com leucemias linfóide crônica (LLC), 43 com leucemia mielóide aguda (LMA), 44 com leucemia linfóide aguda (LLA) e 72 com LMC. A pesquisa da proteína p53 foi realizada pela citometria de fluxo (CF) após marcação com anticorpo monoclonal anti p53 e a detecção da mutação do gene TP53 para os exons 5 a 9 pelo polimorfismo conformacional de fita simples (SSCP). Adicionalmente foram obtidos dados clínicos e laboratoriais referentes aos pacientes, sendo também infestigado o fenótipo de resistência a multiplas drogas (expressão da gpP, MRP e teste de efluxo da rhodamina 123), expressão das proteínas MDM2, p16, e Bcl-2 e o antígeno Ki-67 pela CF. Paralelamente, foram testados linfócitos de 40 indivíduos sadios e células de linhagens tumorais que serviram como controle de marcação positiva e negativa para a proteína p53 pela CF. a expressão da proteína p53 foi detectada em 63/223 amostras dos pacientes: 14/64 LLC (21,9%), 13/44 LLA (29,5%), 19/43 LMA (44,2%) e 17/72 LMC (23,6%), com níveis mais acentuados nas fases avançadas de LLC, LLA e LMC. As alterações do SSCP foram observadas em 11/71 casos de LMC estando mais presentes nas fases mais avançadas, correlacionando-se com a expressão da proteína p53 na maioria dos casos. Observamos correlação entre a expressão das proteínas p53 e gpP na LMC e LMA; p53 e MRP na LMC, LLC e LMA; p53 e Bcl-2 na LMC e LMA; p53 e MDM2 na LLA, LMA e LLC, p53, e p16 na LLA e co-expressão p53 e fenótipo funcional MDR LMC. Houve também correlação entre a expressão da proteína p53 e alguns fatores prognósticos desfavoráveis: tempo de duplicação de linfócitos, expressão de CD38, níveis de LDH e , beta 2 microglobulina e plaquetopenia na LLC, plaquetopenia, contagem de blastos no sangue periférico maior que 30%, esplenomegalia e hepatomegalia na LMC; plaquetopenia e anemia severa na LMA. Nossos dados mostram que a expressão da proteína p53 foi observada em todos os tipos de leucemias, entretanto, a sua presença predominou nas formas mais graves da doença, sugerindo que essa proteína possa ser um indicador de agravamento da evolução clínica

Mutations of p53 gene and/or inactivation of p53 protein are the most common alterations observed in human tumors. In leukemias these alterations are not very frequent, but are they prevail in more serious or refractory cases. The objective of this study was to evaluate p53 protein expression in leukemias and TP53 gene mutations in patients with chronic myeloid leukemia. Peripheral blood and bone marrow samples from 64 patients with chronic lymphoid leukemia (CLL), 43 with acute myeloid leukemia (AML), 44 with acute lymphoid leukemia (ALL) and 72 with chronic lymphoid leukemia (CML) were evaluated. To the study of p53 protein, flow cytometry was performed after labeling with monoclonal antibody anti-p53. The TP53 mutations to exons 5 to 9 were detected by single strand conformational polymorphism (SSCP). Additionally, clinical and laboratorial data from patients were collected, and the multi drug resistance phenotype (gpP and MRP expression, rhodamine 123 efflux test), the expression of MDM-2, p16 and Bcl-2 proteins and Ki–67 antigen by FC were also investigated. Lymphocytes from 40 healthy donors and tumor lineage cells were used as positive and negative controls to p53 protein by FC. Expression of p53 protein was observed in 63/223 patients’ samples: 14/64 CLL (21.9%), 13/44 ALL (29.5%), 19/43 AML (44.2%) and 17 / 72 LMC (23.6%) with the highest levels in the advanced phases of CLL, ALL and CML. SSCP alterations were observed in 11/71 samples of LMC, most of them in the advanced phases of CML and these alterations were correlated with p53 protein expression in most cases. Correlations between p53 and gpP expression was in CML and AML; p53 and MRP in CML, CLL and AML, p53 and Bcl-2 in CML and AML; p53 and MDM-2 in ALL, AML and CLL and p53 and p16 in ALL and co-expression of p53 and MDR functional phenotype LMC. We also observed correlations between p53 protein expression and some unfavorable prognostic factors: lymphocytes duplication time, CD38 expression, LDH and beta 2 micro globulin levels and thrombocytopenia in CLL; thrombocytopenia, count of blasts in peripheral blood higher than 30% , and hepatosplenomegaly in LMC, thrombocytopenia and severe anemia in LMA Our data show that p53 protein expression was observed in all kind of leukemia. However, its presence was higher in the severe forms of the disease, suggesting that this protein can be used as an indicator aggravation of clinical evolution

Determinação de monoclonalidade nas doenças linfoproliferativas crônicas de células B por citometria de fluxo / Monoclonality detrmination by flow cytometry in B cell chronic lymphoproliferative diseases

Diversos estudos têm sugerido que a análise de distribuição de cadeias leves de imunoglobulinas kappa e lambda através da citometria de fluxo (FC), fornece evidências de perfil de monoclonalidade de células tumorais de origem B, em pacientes com doenças linfoproleferativas crônicas de células B (DLC-B). Objetivos: Investigar a eficácia da citometria de fluxo (CF) na detrminação da monoclonalidade de DLC-B mediante o estudo da expressão de cadeias imunoglobulinas kappa e lambda. Materiais e métodos: Foram analisadas amostras de sangue periférico de 43 pacientes com DLC-B. As amostras foram imunofenotipadas por CF com um painel constituído de anticorpos monoclonais (AcMo): CD3, CD4, CD5, CD7,CD8, CD14, CD16, CD19, CD22, CD23, CD25, CD38, CD45, CD56, HLADR, anti-cadeia pesada das imunoglobulinas (IgH), anti-cadeia pesada da imunoglobulina (IgM) e anti-cadeias leves das imunoglobulinas kappa e lambda.Adicionalmente informações sobre idade, sexo e dados clínicos e laboratoriais presentes ao diagnóstico foram avaliados. Resultados: Observou-se uma relação kappa/lambda maior que 10:1 indicativa de proliferação maligna B em todas as amostras estudadas com expressão de cadeia leve do tipo kappa em 86% e lambda 14% das amostras. Análises dos resultados da imunofenotipagem associados a dados clínicos e hematológicos confirmaram 35 casos de leucemia linfocítico crónica, 3 casos de leucemia pró-linfocítica B, 3 hairy cell leukemia, 1 linfoma de células do manto e macroglobulinemia de Waldenstrom também em um caso. Conclusões. Os resultados obtidos mostraram que a análises da expressão das cadeias leves kappa e lambda pela CF é uma metodologia rápida e eficaz na detecção de proliferação maligna de linfócitos B.

Citometria de fluxo, imunocitoquimica e western blot na detecção da expressão da proteína p53 em células tumorais: uma análise comparativa / Flow cytometry, immunocytochemistry and western blot in measurement of p53 protein expression in tumor cells: a comparative analysis

Introdução e objetivos: p53 é a proteína cuja função é crucial no controle do ciclo celular, reparo do DNA e indução de apoptose de células geneticamente instáveis. O Western Blot (WB) e a imunocitoquímica (ICQ) são atualmente os métodos de detecção mais empregados da proteína p53, se tratando, porém de técnicas de execução demorada e trabalhosa. O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma metodologia rápida para detecção e quantificação da proteína p53 em células tumorais através da citometria de fluxo (CF). Material e métodos:Empregou-se 14 linhagens de células tumorais humanas: Namalva, Raji e Daudi (linfoma de Burkitt), C91 e MT-2 (leucemia de células T do adulto), Jurkat (leucemia linfoblástica de células T), HL-60 (leucemia promielocítica), HT-29 (adenocarcinoma de colon), GLC-4 (carcinoma de pulmão), MCF-7 (carcinoma de mama), H460 e H460/bcl-2 (carcinoma de células não pequenas de pulmão), k562 e lucena (leucemia mielóide crônica em crise blástica) e C6 (astrocitoma originária de rato). Paralelamente, linfócitos provenientes de 36 indivíduos sadios serviram como controle da reação negativa. A iCQ foi realizada pelo método da imunoperoxidase indireta, a CF por marcação direta com anticorpo monoclonal anti-p53 diretamente conjugado ao isotiocianato de fluoresceína após permeabilização celular e o WB através do método padrão. A quantificação antigênica foi realizada através da média de intensidade de fluorescência na CF e densitometria no WB. Resultados: Observou-se uma correlação direta entre os resultados da CF, WB e ICQ, com expressão positiva nas linhagens Namalva, Raji, HT-29, GLC-4, MT-2, C91pl, MCF-7, H460 e H460/bcl-2 e negativa nas demais linhagens e em todas as células do grupo controle. A ICQ foi eficaz na demonstração da presença da p53 no núcleo da célula e a CF e WB permitiram também a quantificação antigênica, evidenciando células com variados níveis de expressão antigênica. A CF quando comparada ao WB apresentou maior sensibilidade. Conclusões: Nossos resultados mostraram que a proteína p53 pode ser detectada em células tumorais através da CF. Esta metodologia é eficaz, sensível e prática, podendo ser empregada rotineiramente em estudos de expressão da proteína p53 em células tumorais.

p53 e as hemopatias malignas / p53 and hematological malignancies

p53 é um gene supressor tumoral, que codifica uma fosfoproteína nuclear que desempenha um papel importante no controle do ciclo celular, no reparo do DNA e na indução da apoptose. Em condições de stress, particularmente por indução de dano no DNA, a proteína p53 bloqueia o ciclo celular, permitindo dessa forma o reparo do DNA ou promovendo a apoptose. Estas funções são efetuadas pela capacidade transcricional da proteína p53 que ativa uma série de genes envolvidos na regulação do ciclo celular. A forma mutada da p53 é incapaz de controlar a proliferação celular, resultando em reparo ineficiente do DNA e na emergência de célulasgeneticamente instáveis. As alterações mais comuns nas neoplasias são mutações pontuais dentro das seqüências codificantes deste gene. Nas hemopatias malignas, estas mutações, freqüentemente do tipo pontuais, têm sido observadas com menor ocorrência do que em tumores sólidos. Nas neoplasias hematológicas estas alterações são mais observadas na crise blástica da leucemia mielóide crônica, progressão da síndrome mielodisplásica para leucemia mielóide aguda, na transformação do linfoma folicular para linfoma de alto grau, na evolução da leucemia linfóide crônica para síndrome de Richter e recorrência de leucemias agudas. Esta revisão tem como objetivo avaliar as alterações do gene p53 nas hemopatias malignas e discutir o significado clínico destas alterações genéticas na patogenia e prognóstico nessasneoplasias.